Fundamentos de Engenharia Genética

As experiências conduzidas por Gregor Mendel e Friedrich Miescher a meio do século XIX foram a base para a descoberta do DNA e o estudo da genética. A modernização de tecnologias e o contínuo interesse em estudar e descobrir novos genomas levam a que, no século XXI, sejam esperados extraordinários avanços em vários campos da atividade humana, em particular no que diz respeito ao conhecimento sobre a biologia dos organismos e à capacidade de a manipular.  

O DNA (ácido desoxirribonucleico) é o material genético de todos os seres vivos, à excepção de alguns vírus, constituídos por RNA (ácido ribonucleico). Como material hereditário, o DNA deve preencher três requisitos fundamentais: 1) ser reproduzido com alta precisão (replicação), de modo a haver conservação das espécies; 2) ser passível de sofrer alterações (recombinação e mutação), para a evolução das espécies; 3) conter informação para a formação de proteínas, que são o suporte estrutural e funcional de uma célula.  

O percurso que o DNA faz até à formação de proteínas envolve várias etapas, sendo a primeira, a etapa de transcrição. A transcrição assume-se como o mecanismo universal da expressão de genes, unidades de DNA que contêm a informação necessária à especificidade da síntese de todas as formas funcionais de RNA de cada célula.  A transcrição, nos eucariotas, ocorre no núcleo, onde se encontra o DNA genómico (com excepção da transcrição mitocondrial ou cloroplástica), enquanto a tradução tem lugar no citoplasma (Figura 3). Nestas circunstâncias todo o RNA, quer seja mRNA, tRNA ou rRNA tem que migrar do núcleo para o citoplasma, onde desempenham as respectivas funções no processo de síntese de proteínas. 

As células eucarióticas, ao contrário dos procariotas, apresentam uma maior complexidade na biossíntese de formas funcionalmente ativas dos diversos tipos de RNA. As dimensões e complexidade da estrutura molecular e supramolecular do genoma conduzem a maiores exigências, implicando a existência de fenómenos de seleção, reconhecimento e transcrição dos diversos genes ou grupos de genes, que estão na base da expressão de cada fenótipo celular. 

Nas células procarióticas, a transcrição e a tradução ocorrem no mesmo espaço celular e a transcrição da totalidade dos genes é catalisada por uma única RNA polimerase, independentemente da função e propriedades do RNA a que dá origem.  Nestes seres, as cadeias de RNA produzidas, nomeadamente os mRNA, são imediatamente traduzidos em cadeias polipeptídicas, que assim refletem de forma direta as consequências nucleotídicas do DNA genómico que lhe serviu de molde.  

A conversão de nucleótidos do mRNA em aminoácidos é mediada pelo código genético e consiste num processo complexo de múltiplas reacções em que intervêm, essencialmente, o mRNA, resultante da transcrição do gene codificante para a proteína, o tRNA e factores proteicos. Para que os 20 aminoácidos possam ser codificados por combinação de apenas quatro nucleótidos diferentes, a leitura do mRNA nos ribossomas é conseguida pela utilização de grupos de três, o que permite a formação de 64 tripletos (codões), que constituem o código genético. Apesar de haver preferência pelo uso de certos codões nos diversos organismos, o código genético é considerado universal, salvo algumas excepções. O código genético é também degenerado pois muitos dos aminoácidos podem ser codificados por mais que um codão.  

Estrutura Proteica  

As proteínas são polímeros essenciais para a função, estrutura, diferenciação e desenvolvimento de um organismo. Uma proteína é constituída por uma ou várias cadeias peptídicas formadas por sequências específicas de aminoácidos. Em cada proteína, os aminoácidos encontram-se ligados pelos seus grupos carboxílicos ao grupo amínico de aminoácido, adjacente por uma ligação peptídica. A nível de estrutura, as proteínas possuem estruturas complexas com quatro níveis de organização distintas. 

Clonagem e expressão de Proteínas Recombinantes 

A produção de proteínas constitui uma das mais importantes aplicações da engenharia genética. O aparecimento da biologia molecular, nos anos 70, tornou possível a produção de proteínas heterólogas em diferentes células hospedeiras representando uma alternativa à extração da proteína original. A extração clássica permite normalmente concentrações muito baixas tornando-a muito dispendiosa e, muitas vezes, impossível de implementar. Um outro problema associado é a pureza da proteína obtida que pode não ser suficiente para eliminar contaminações tóxicas, pirogénas ou infecciosas.   

No entanto, a expressão de proteínas recombinantes necessita de um planeamento correto que vise a produção destas na conformação correta permitindo o estado solúvel e ativo. Para isso são necessários elementos essenciais: Identificação e localização do gene de interesse, inserção do gene alvo num vector adequado, introdução do vector no hospedeiro designado, seleção de células transformantes e multiplicação/expressão do gene escolhido no hospedeiro. 

Escherichia coli continua a ser o hospedeiro preferido para a expressão de proteínas recombinantes e as razões do seu uso são bem conhecidas: facilidade de manipulação genética, culturas de baixo custo e uma expressão rápida, com as proteínas a serem normalmente produzidas num só dia. Aliada a estas características, a expressão por E. coli é um sistema robusto com a proteína expressa a compreender até 50% da totalidade das proteínas celulares.  

Uma vez determinada a proteína de interesse e a correspondente construção, deve ser subclonada num vector que contenha todos os elementos necessários à transcrição e tradução do gene alvo. Os plasmídeos, pela sua maneabilidade, são os vectores de expressão por excelência que permitem clonar genes ou fragmentos de DNA específicos. 

Técnicas utilizadas em Engenharia Genética 

De modo a obter a proteína recombinante são utilizadas várias metodologias de DNA recombinante, tais como, extração e purificação de DNA em gel de agarose, PCR, digestão de DNA com enzimas de restrição, ligação de DNA, transformação em células competentes, entre outros. 

Vídeo 1

 

 PCR – Reação em cadeia da polimerase

A reação em cadeia da polimerase é uma técnica de biologia molecular que permite replicação in vitro do DNA de forma extremamente rápida. Durante o PCR são usadas temperaturas elevadas de forma a separar as moléculas de DNA em duas cadeias simples. Isto possibilita a ligação de oligonucleótidos iniciadores (primers) que são complementares das sequências que flanqueiam o fragmento de DNA a amplificar, de modo a permitir a atuação da DNA polimerase durante a síntese da cadeia complementar e usando como molde cada uma das duas cadeias simples constituintes do DNA a amplificar. Este processo que tem lugar num termociclador.  

Vídeo 2

Vídeo 3

Electroforese de DNA em gel 

A electroforese em gel de agarose é a forma mais eficaz de separar fragmentos de DNA. Deste modo, é amplamente usada em técnicas de biologia molecular para separar e estimar o tamanho de fragmentos de ácidos nucleicos. Através da ação de um campo eléctrico é possível fazer a comparação da distância percorrida pelos fragmentos de interesse com a percorrida por fragmentos de peso molecular conhecido (padrões de peso molecular), permitindo estimar  o peso molecular de cada fragmento da amostra a analisar. Assim, quando sujeitos a um campo eléctrico, os ácidos nucleicos migram em direção ao pólo positivo, uma vez que, a pH neutro apresentam carga negativa. Já a matriz de agarose funciona como uma rede cujos poros deixam passar mais facilmente as moléculas mais pequenas, que vão migrar mais do que as de maiores dimensões. 

Vídeo 3

Concluindo

Estamos bem longe de uma tecnologia “inocente” que não levanta questões de ética nem afronta a vida de um cidadão. Tenhamos ou não profissões ligadas à Biologia, todos somos chamados a acompanhar e a refletir sobre as notícias que lemos e a equacionar em cada momento as opções que fazemos e as decisões que tomamos. Precisamos, sobretudo, de exercer uma cidadania responsável, permanentemente atenta às vantagens da tecnociência mas alertada para os seus riscos, não permitindo que se ponha em causa a vida e a sua qualidade.

Referências:  

Videira, A. Engenharia Genética: Princípios e Aplicações. Lisboa: LIDEL, 2001. 

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